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ELISA應(yīng)用的一些說明:克服非特異性吸附
更新時間:2011-06-10 點擊量:3686

ELISA應(yīng)用的一些說明:克服非特異性吸附

ELISA中,非特異性吸附是值得注意的問題,如果抗原或抗體純化不過關(guān),產(chǎn)生非特異性吸附是實驗操作中無法避免的。

但是,即使抗原抗體的純化達到一定水平,還是有可能產(chǎn)生非特異性吸附。例如塑料載體表面的吸附,為了避免非特異性顯色,需用含Tween20PBS或生理鹽水作為洗脫液,吐溫 (Tween)就是指聚氧乙烯去水山梨醇脂肪酸酯,為非離子型的表面張力物質(zhì),常作為助溶劑。根據(jù)它與聚合山梨醇所結(jié)合的脂肪酸種類不同而進行吐溫編號,結(jié)合月桂酸的為吐溫20,結(jié)合棕櫚酸的為溫40,結(jié)合硬脂酸的為吐溫60,結(jié)合油酸的為吐溫80。在免疫酶技術(shù)中常用含吐溫20PBS作洗滌劑或作稀釋樣品和酶標(biāo)抗體(抗原)之用,它的洗滌效果要比牛血清蛋白溶液(0.5%)好,具有減少非特異性吸附和增強抗原抗體結(jié)合的作用。吐溫20的使用量一般在0.06%-0.1%.有學(xué)者認(rèn)為,Tween20還有增強特異性反應(yīng)的作用。另外,檢測血清和酶標(biāo)記抗體用含0.5%-1%牛血清白蛋白(或0.1%白明膠)稀釋也能得到增強特異性吸附的作用。樣品首先用稀釋的健血清孵育,也有助于去除非特異性顯色。除此之外,反應(yīng)的時間和掌握反應(yīng)劑zui適濃度,也有助于克服非特異性吸附。反應(yīng)一般需4~5h25),如要減少反應(yīng)時間則可升至37,雖然反應(yīng)溫度為37時對靈敏性和準(zhǔn)確性稍有影響,但是減少了保溫時間(需2~3h),對結(jié)果影響并不大,因此,37被經(jīng)常采用。酶標(biāo)記抗體的濃度太高,易出現(xiàn)假陽性;太低,則不靈敏。所用待測樣品、酶標(biāo)記抗體和抗抗體的zui適濃度,通過實驗才能獲得。在一定范圍內(nèi),ELISA的反應(yīng)強度與待測樣品濃度的對數(shù)呈線性關(guān)系,通過一系列不同稀釋度的待測樣品的測定,才能得出待測樣品的zui適稀釋度范圍。另外,由于加入固相載體進行致敏的抗原量過多,因而造成的前帶(prozone)效應(yīng),也可以通過測試抗血清的稀釋度而消除,因為在抗體zui適量的情況下,多余的抗原也不起干擾作用。關(guān)于酶標(biāo)記抗體的zui適濃度,可以通過劑量反應(yīng)曲線(一系列稀釋的陽性和陰性血清,與同一濃度的酶標(biāo)記抗體反應(yīng)),選擇同一稀釋度的陽性和陰性血清分別對不同稀釋度的酶標(biāo)記抗體反應(yīng)而確定。陽性血清的吸收值與陰性血清的吸收值之比為zui大值時,酶標(biāo)記抗體的濃度為zui適濃度。

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