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動(dòng)物組織/細(xì)胞RNA提取試劑盒操作步驟
更新時(shí)間:2021-11-29 點(diǎn)擊量:1734

  

 

動(dòng)物組織/細(xì)胞RNA提取試劑盒說明書

RNApure Tissue Kit

Cat. No.   K0584

保存:室溫

 

組分說明

 

                                      Cat. No.                      K0584

                                      Kit Size                         50

                                      Buffer RL                       35 ml

                                      Buffer RW1                      40 ml

                                      Buffer RW2concentrate)         11 ml

                                      RNase-Free Water                10 ml

                                      Spin Column RM                   50

                                      Collection Tube1.5 ml)          50

                                      Collection Tube2 ml)            50

 

產(chǎn)品簡介

     本試劑盒將高效的異硫氰酸胍裂解技術(shù)與硅基質(zhì)膜純化技術(shù)相結(jié)合,可從動(dòng)物細(xì)胞及組織中高效提取總 RNA。起始樣本一般最多 30 mg 組織或 1 x 10 細(xì)7胞。本試劑盒還可回收未*純化的 RNA、體外轉(zhuǎn)錄和酶促反應(yīng)后得到的 RNA。用本試劑盒可提取純化分子量大于 200 堿基的高品質(zhì) RNA,幾乎無 DNA 殘留。如果要進(jìn)行對(duì)微量 DNA 非常敏感的 RNA 實(shí)驗(yàn),殘留的 DNA 可利用無 RNase DNase I 在柱上進(jìn)行消化去除。提取的 RNA 可用于 RT-PCRNothern Blot、Dot Blot等下游實(shí)驗(yàn)。

 

注意事項(xiàng)

 

1.  預(yù)防RNase污染,應(yīng)注意以下幾方面:

1) 使用無RNase的塑料制品和槍頭,避免交叉污染。

 

2) 玻璃器皿應(yīng)在使用前于180℃高溫下干烤4小時(shí),塑料器皿可在0.5 M NaOH中浸泡10分鐘,用水*沖洗后高壓滅菌。

3) 配制溶液應(yīng)使用無RNase的水。

 

4) 操作人員戴一次性口罩和手套,實(shí)驗(yàn)過程中要勤換手套。

 

2.  提取的樣品避免反復(fù)凍融,否則影響 RNA 提取的量和質(zhì)量。

 

3.  使用前請(qǐng)檢查 Buffer RL 是否出現(xiàn)結(jié)晶或者沉淀,可置于 56℃加熱重新溶液。Buffer RL 在使用前請(qǐng)加入β-巰基乙醇,

    至終濃度為 1%。如 1ml Buffer RL 10μl β-巰基乙醇。加入β-巰基乙醇的 Buffer RL 室溫可保存 1 個(gè)月。

 

4.  第一次使用前應(yīng)按照試劑瓶標(biāo)簽的說明先在 Buffer RW2 中加入無水乙醇。

 

5.  所有離心步驟如無特殊說明均在室溫下進(jìn)行,且所有操作步驟動(dòng)作要迅速。

 

6.  若下游實(shí)驗(yàn)對(duì) DNA 非常敏感,建議用不含 RNase DNase I(貨號(hào):YJ2090A)對(duì) RNA 進(jìn)行處理。

 

自備試劑:  β-巰基乙醇、無水乙醇(新開封或提取RNA專用)  

 

 

操作步驟

 

1.  樣品處理

 

    1a.  組織:將組織在液氮中磨碎。每20-30 mg組織加600 μl Buffer RL(使用前檢查是否加入β-巰基乙醇),組織樣本少于20 mg350  μl Buffer RL。樣品體積不超過Buffer RL體積的十分之一。

 

    1b  單層培養(yǎng)細(xì)胞:將細(xì)胞在培養(yǎng)瓶中直接裂解或處理成細(xì)胞懸液,離心得到細(xì)胞沉淀,棄上清,每6-10 cm2培養(yǎng)面積加入600  μl Buffer RL,小于6 cm2加入350  μl Buffer RL,反復(fù)吹打幾次,使其充分裂解。

1c.  細(xì)胞懸液:12,0006 rpm(~13,400×g)離心1分鐘棄上清,得到細(xì)胞沉淀。每5×10 6-1×107 細(xì)胞加入600 μl Buffer RL

注意:,少于1)盡量除盡5×10 細(xì)細(xì)胞加入胞培養(yǎng)350基, 細(xì) μl胞培 Buffer養(yǎng)基可能抑制 RL,反復(fù)細(xì)胞的裂解影響吹打幾次,使其充分裂解。RNA產(chǎn)量。

 

             2)盡量使細(xì)胞充分懸浮并充分裂解,否則影響RNA產(chǎn)量。

 

2.  樣品充分裂解后,室溫放置5分鐘,使蛋白核酸復(fù)合物*分離。

 

3.  12000rpm離心2-5min,取上清進(jìn)行下步操作。

 

4.  加入1倍體積(600  μl350 μl)的70%乙醇(無RNase水配制),混勻。

 

    注意:加入乙醇后可能會(huì)產(chǎn)生沉淀,不會(huì)影響后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

 

5.  將步驟4所得溶液全部加入到已裝入收集管(Collection Tube 2 ml)的吸附柱(Spin Column RM)中,若一次不能將全部溶液加入吸附柱中,請(qǐng)分兩次轉(zhuǎn)入,12,000 rpm離心1分鐘,倒掉收集管中的廢液,將吸附柱放回收集管中。

 

    注意:吸附柱的最大載量為100 µg不要超載,否則會(huì)影響RNA的產(chǎn)量和純度。

 

6. 向吸附柱中加入700  μl Buffer RW1, 12,000 rpm離心1分鐘,倒掉收集管中的廢液,將吸附柱放回收集管中。

 

    可選步驟:如果要進(jìn)行對(duì)微量DNA非常敏感的RNA實(shí)驗(yàn),則用以下步驟替代步驟6。

 

    1)向吸附柱中加入350  μl Buffer RW1, 10,000 rpm離心15秒,棄廢液,將吸附柱重新放回收集管中。

 

    2)配制DNase I  混合液:取52 μl RNase-Free Water,向其中加入8  μl 10×Reaction Buffer 20  μl DNase I1 U/μl),混勻,配制成終體積為80  μl DNase I混合液。

 

       注意:  以上體系為按照我公司產(chǎn)品DNase I K2090A)反應(yīng)體系進(jìn)行配置,應(yīng)用其他公司產(chǎn)品請(qǐng)參考相應(yīng)說明書。

 

    3)向吸附柱中直接加入80 µl DNase I  混合液,20-30℃孵育15分鐘。

 

    4)向吸附柱中加入350  μl Buffer RW1, 10,000 rpm離心15秒,棄廢液,將吸附柱重新放回收集管中。

 

7.   向吸附柱中加入500  μl Buffer RW2(使用前檢查是否加入無水乙醇), 12,000 rpm離心1分鐘,倒掉收集管中的廢液,將吸附柱放回收集管中。

 

8.   重復(fù)步驟7。

 

9.   12,000 rpm離心2分鐘,倒掉收集管中的廢液。將吸附柱置于室溫?cái)?shù)分鐘,以*晾干。

 

     注意:這一步的目的是將吸附柱中殘余的乙醇去除,乙醇的殘留會(huì)影響后續(xù)的酶促反應(yīng)(酶切、PCR 等)。

 

10.  將吸附柱置于一個(gè)新的無  RNase 離心管(Collection  Tube  1.5 ml)中,向吸附柱的中間部位懸空加入  30-50  μl

    RNase-Free Water,室溫放置 1 分鐘,12,000 rpm 離心 1 分鐘,收集 RNA 溶液,-70℃保存 RNA,防止降解。

 

注意:1RNase-Free Wate體積不應(yīng)小于30  μl,體積過小影響回收率。

 

2)如果要提高RNA的產(chǎn)量,可用30-50  μl新的RNase-Free Water重復(fù)步驟10

 

3)如果要提高RNA濃度,可將得到的溶液重新加入到吸附柱中,重復(fù)步驟10。


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